| EN ESTE TRABAJO DE TESIS SE INVESTIGO SI HAY UNA CA2+-ATPASA DE MEMBRANA PLASMATICA (PMCA) EXPRESANDOSE EN LOS CILIOS OLFATORIOS Y SI ESTA PARTICIPA EN LA EXTRACCION DEL CA2+ DESDE EL LUMEN LUEGO DE PRODUCIRSE UN INCREMENTO DE ESTE ION EN DICHO ORGANELO. EVIDENCIAS PREVIAS INDICABAN QUE UN INTERCAMBIADOR NA+/CA2+ (NCX) ERA EL RESPONSABLE DE LA REMOCION DEL CA2+ DESDE LOS CILIOS. LA EXPRESION Y DISTRIBUCION DE LA PMCA Y DEL NCX SE INDAGO MEDIANTE WESTERN BLOT EN VESICULAS DE MEMBRANAS CILIARES PRUFICADAS DE NEURONAS OLFATORIAS, INMUNIOCITOQUIMICA EN CELULAS DISOCIADAS DE EPITELIO OLFATORIO E INMUNOHISTOQUIMICA DE CORTES DE EPITELIO OLFATORIO. LA PMCA, EN EFECTO, SE EXPRESA EN LOS ORGANELOS SENSORIALES DEL OLFATO, MOSTRANDO UNA DISTRIBUCION DISCRETA A LO LARGO DE ESTOS. LA ACTIVIDAD DE ESTA BOMBA SE CARACTERIZO MIDIENDO LA ACUMULACION DE 45CA2+ EN VESICULAS INVERTIDAS PURIFICDAS DE CILIOS OLFATORIOS. SE DETERMINO QUE SU ACTIVIDAD ES DEPENDIENTE DEL CA2+ INTRACELULAR (K0.5 = 670 NM). LA BOMBA INCREMENTA SUS NIVELES DE ACTIVIDAD 5 VECES AL AUMENTAR LA CONCENTRACION DE CA2+ LIBRE A PARTIR DE 300 NM CON UN MAXIMO DE ACTIVIDAD A 1 UM CA2+. EL CA2+ REGULA LA ACTIVIDAD DE LA BOMBA MEDIANTE CALMODULINA (K0.5 = 31 NM). LA ACTIVIDAD DE LA BOMBA ES INHIBIDA EN AUSENCIA NOMINAL DE ATP, ASI COMO CUANDO ES EXPUESTA AL BLOQUEADOR CARBOXYEOSINA (CE) Y AL INHIBIDOR DE CAM CALMIDAZOLIO. LAS CARACTERISTICAS BIOQUIMICA DE LA BOMBA INDICAN QUE LA PMCA CILIAR PODRIA PERTENECER A LAS ISOFORMAS 1 O 4. LAS 4 ISOFORMAS DE LA PMCA SE EXPRESAN EN LAS MEMBRANAS CILIARES, PARECIENDO ESTAR MAS REPRESENTADA LA PMCA 4 RESPECTO DE LAS OTRAS TRES. LA PARTICIPACION FUNCIONAL DE LA PMCA EN LA REMOCION DE CA2+ CILIAR, ASI COMO LA DEL NCX, SE ESTUDIO DETERMIANDO LA CONSTANTE DE RELAJACION DE LA CORRIENTE TOTAL DE C1- ACTIVADA POR CA2+ (ICACI) COMO INDICADOR DEL CA2+ INTRACILIAR, LUEGO DE ACTIVAR ESTA CORRIENTE MEDIANTE UN AUMENTO RAPIDO DE CA2+. EN CONDICION CONTROL, LA ICACI PRESENTO UNA = 272 +- 78 MS. ESTE VALOR AUMENTO AL INHIBIR LA PMCA CON 100 UM CE (T = 2181 +- 437 MS), OMITIENDO EL ATP EN LA PIPETA DE REGISTRO (T = 666 +- 49 MS) Y ALCALINIZANDO EL MEDIO EXTRACELULAR A PH 9,4 ( T = 725 +- 65 MS). A SU VEZ, AL ANULAR EL NCX REEMPLAZANDO EL NA+ EXTRACELULAR POR LI+, LA CONSTANTE DE RELAJACION DE LA CORRIENTE DE TRANSDUCCION TAMBIEN AUMENTO (T = 442 +- 8 MS). LA PROLONGACION DE LA T DE LA ICICA SUGIRE QUE EL CA2+ PERMANECIA ELEVADO POR UN MAYOR TIEMPO EN LOS CILIOS EN DICHAS CONDICIONES. ESTAS EVIDENCIAS RESPALDAN FUERTEMENTE QUE TANTO LA PMCA COMO EL NCX EXTRAEN CA2+ DESDE LOS CILIOS EN LAS CONDICIONES EXPERIMENTALES UTILIZADAS. POR OTRO LADO, SE MIDIO EL CURSO TEMPORAL DE LA REMOCION DEL CA2+ DESDE LOS CILIOS MEDIANTE MICROSCOPIA DE 2 FOTONES, LUEGO DE PRODUCIR UN INCREMENTO ABRUPTO DEL CA2+ POR FOTOLIBERACION DE CAMP ENJAULADO. LA RELAJACION DE LA SEÑAL FLUORESCENTE DEBIDA A LA RECUPERACION DE LA CONCENTRACION DE CA2+ DEL ESTADO DE REPOSO EN LA CONDICION CONTROL PRESENTO UNA T0.5 = 12,5 +- 2,3 S. ESTA SE PROLONGO AL BLOQUEAR LA PMCA CON CE 50 UM (T0.5 = 28,12 +- 5,2 S). ESTOS RESULTADOS INDICAN QUE TANTO LA PMCA COMO EL NCX PARTICIPAN EN LA REMOCION DEL CA2+ LUMINAL. EL INCREMENTO DE CA2+ EN LOS CILIOS OLFATORIOS OCURRIA DE MANERA ALTAMENTE LOCALIZADA A LO LARGO DEL ORGANELO, OBSERVANDOSE DESTELLOS DE FLUORESCENCIA EN SITIOS DISCRETOS AL FOTOACTIVAR EL CAMP ENJAULADO. LOS TAMAÑOS PROMEDIO DE DICHOS SITIOS DE ENTRADA DE CA2+ ERAN VARIABLES EN LAS DISTINTAS CONDICIONES EXPLORADAS. ESTOS SITIOS SE DIVIDIERON ARBITRARIAMENTE EN CUATRO GRUPOS: AQUELLOS MENORES A 0,4 UM; ENTRE 0,4 Y 0,6 UM; ENTRE 0,6 Y 0,8 UM; Y LOS QUE ERAN MAYORES A 0,9 UM DE ANCHO. EN CONDICIONES CONTROL SE OBSERVO HABITUALMENTE TAMAÑOS DE 0.39 +- 0.08 UM (N=20) Y 0.54 +- 0.03 UM (N=17). EL ANCHO DE ESTOS SITIOS FUE MAYOR CUANDO LAS NSO ESTUVIERON PREVIAMENTE EXPUESTAS A LOS BLOQUEADORES DE NCX Y LA PMCA ALCANZANDO VALORES DE 0.67 +- 0.05 UM (N=14) Y 0.98 +- 0.25 UM (N=13); SUGIERIENDO QUE EL ION CA2+ SE ACUMULA EN LAS CERCANIAS DE ESTOS LUGARES AL ESTAR BLOQUEADOS LOS MECANISMOS QUE LO EXTRAEN. CUANDO LAS NSO SON EXPUESTAS A 1 MM DEL BLOQUEADOR DE LA PDE IBMX LOS PUNTOS DISCRETOS DE INGRESO DE CA2+ SE DISPERSAN, POSIBLEMENTE DEBIDO A UNA ACUMULACION PERSISTENTE DEL ION DENTRO DEL CILIO A CAUSA DE UNA MAYOR DISPONIBILIDAD DE CAMP, AGONISTA DE LOS CANALES CNG. LA REMOCION DEL COLESTEROL, CON CICLODEXTRINA, DE LAS MEMBRANAS TAMBIEN SUPRIMIO LAS SEÑALES LOCALIADAS DE CA2+, OBSERVANDOSE ADEMAS UN NOTABLE RETARDO EN LA ENTRADA DEL ION AL CILIO. ESTO ES CONSISTENTE CON UNA PARTICIPACION DE DOMINIOS RICOS EN COLESTEROL EN LA FORMACIN Y MANTENCION DE DICHOS SITIOS. POR OTRO LADO, CUANDO SE EXPLORO LA DISTRIBUCION DE LA PMCA Y EL CANAL CNG, INTERESANTEMENTE SE OBSERVO QUE AMBAS PROTEINAS COLOCALIZABAN Y SE DISTRIBUIAN DE MANERA PARTICULADA AL O LARGO DE LOS CILIOS. ESTO ES CONGRUENTE CON UNA DISPOSICION LOCALIZADA DE LOS LUGARES POR DONDE ENTRA CA2+ AL CILIO, SUGIRIENDO QUE LA MAQUINARIA DE QUIMOTRANSDUCCION PODRIA FORMAR COMPLEJOS MOLECULARES DONDE SE AGRUPAN LOS COMPONENTES DE LA TRANSDUCCION OLFATORIA. EN CONCLUSION EN LOS CILIOS OLFATORIOS HAY UNA CA2+ -ATPASA DE MEMBRANA PLASMATICA QUE, EN LAS CONDICIONES ESTUDIADAS, PARTICIPA EN LA EXTRACCION DEL CA2+ QUE INGRESA AL LUMEN AL ACTIVARSE LOS CANALES CNG. SE CONFIRMO, ADICIONALMENTE, QUE EN LA REMOCION DE CA2+ CILIAR TAMBIEN PARTICIPA UN INTERCAMBIADOR NA+/CA2+. ESTOS DOS TRANSPORTADORES DE CA2+ PODRIAN ESTAR FUNCIONANDO DE MANERA COMPLEMENTARIA PARA SACAR EL CA2+ DURANTE LA RESPUESTAñoDORIFERA. ES PROBABLE QUE DEBIDO A LA NATURALEZA ELECTROGENICA DEL NCX, SU EFICIENCIA SE VEA DISMINUIDA CON LA DESPOLARIZACION CELULAR INDUCIDA POR OLORES. A SU VEZ LA DISPONIBILIDAD LIMITADA DE ATP EN EL CILIO PODRIA IMPEDIR QUE LA BOMBA FUNCIONE DE MANERAñoPTIMA DURANTE TODO EL TIEMPO QUE DURA LA RESPUESTAñoDORIFERA. DE ESTE MODO, LA PMCA Y EL NCX PODRIAN SER COMPLEMENTARIOS EN EL TRABAJO DE REMOCION DEL CA2+ DESDE EL LUMEN CILIAR. |