| EL COBRE ES UN ELEMENTO TRAZA INDISPENSABLE PARA TODAS LAS CELULAS, YA QUE ACTUA COMO COFACTOR EN UNA SERIE DE IMPORTANTES REACCIONES CELULARES. SIN EMBARGO, A CONCENTRACIONES SUPERIORES A LAS REQUERIDAS FISIOLOGICAMENTE, SE VUELVE TOXICO PUES CATALIZA LA FORMACION DE ESPECIES REACTIVAS DE OXIGENO. POR ELLO LAS CELULAS HAN DESARROLLADO SISTEMAS PARA EVITAR QUE LAS CONCENTRACIONES INTRACELULARES DEL METAL ALCANCEN VALORES ELEVADOS, LOS QUE SE CONOCEN COMO MECANISMOS DE RESISTENCIA. EN GENERAL LOS NIVELES DE RESISTENCIA A COBRE DE LOS MICROORGANISMOS CORRESPONDEN A VALORES DE CONCENTRACION MINIMA INHIBITORIA MENORES A 5 MM. SIN EMBARGO, SE HAN DESCRITO ESPECIES CAPACES DE CRECER EN CONCENTRACIONES DEL METAL DE HASTA DOS ORDENES DE MAGNITUD SUPERIORES. ESTOS MICROORGANISMOS SE HAN AISLADO DESDE DRENAJES ACIDOS DE MINAS, UN AMBIENTE EXTREMO QUE TIENE UN PH MUY BAJO Y ALTAS CONCENTRACIONES DE METALES PESADOS. DENTRO DE ESTAS ESPECIES RESISTENTES SE ENCUENTRA LA BACTERIA ACIDITHIOBACILLUS FERROOXIDANS, UNA ESPECIE GRAM NEGATIVA Y QUMIOLITOAUTOTROFA QUE UTILIZA ION FERROSO, AZUFRE ELEMENTAL O SUS ESPECIES REDUCIDAS COMO FUENTES DE ENERGIA. A. FERROOXIDANS HA SIDO INTERESAMENTE ESTUDIADA DEBIDO A QUE PARTICIPA EN PROCESOS DE BIOLIXIVIACION DE COBRE, DONDE LOS MICROORGANISMOS ESTAN EXPUESTOS A ALTAS CONCENTRACIONES DEL METAL, LAS QUE PROBABLEMENTE SON UN FACTOR LIMITANTE PARA SU DESARROLLO. EN ESTE TRABAJO ESTUDIAMOS LOS MECANISMOS MOLECULARES DE RESISTENCIA A COBRE DE A. FERROOXIDANS, COMO UNA MANERA DE CONOCER LOS ELEMENTOS QUE LOS CONFORMAN, Y QUE PUEDEN RESULTAR UTILES EN POTENCIALES MEJORAS GENETICAS DE MICROORGANISMOS BIOLOXIVIANTES PARA SU MEJOR DESARROLLO EN LAS CONDICIONES DEL PROCESO. COMO PARTE DE LOS RESULTADOS DE ESTA TESIS, SE REALIZO UNA BUSQUEDA BIOINFORMATICA DE POSIBLES DETERMINANTES DE RESISTENCIA A COBRE EN EL GENOMA DE A. FERROOXIDANS ATCC 23270, A PARTIR DE LA CUAL SE IDENTIFICARON AL MENOS DIEZ ORFS QUE PODRIAN CODIFICAR PARA PROTEINAS RELACIONADAS AL FLUJO DE COBRE DESDE EL CITOPLASMA, COMO PARA ALGUNAS CHAPERONAS QUE LO PODRIAN CAPTURAR EN EL PERIPPLASMA DE LA BACTERIA. AL HACER UN ANALISIS DE LA EXPRESION Y FUNCIONALIDAD DE ESTOS ORFS, SE OBSERVO QUE TODOS ELLOS AUMENTAN SU EXPRESION FRENTE A LA EXPOSICION AL METAL, Y LA MAYORIA DE ELLOS AUMENTA LA RESISTENCIA DE E. COLI A COBRE CUANDO SE EXPRESAN EN ESTA BACTERIA. DADO QUE LOS DETERMINANTES DE RESISTENCIA A COBRE DE A. FERROOXIDANS SON SIMILARES A LOS ENCONTRADOS EN OTRAS BACTERIAS, ESTOS NO EXPLICAN ENTERAMENTE LA ALTA RESISTENCIA DE LAS BACTERIAS BIOLIXIVIANTES. POR ELLO, EXISTE TAMBIEN LA POSIBILIDAD DE QUE A. FERROOXIDANS PRESENTE DETERMINANTES DE RESISTENCIA A COBRE NO DESCRITOS EN OTROS MICROORGANISMOS. PARA ANALIZAR ESTA POSIBILIDAD, SE DESARROLLARON EXPERIMENTOS DE PROTEOMICA, MEDIANTE LA SEPARACION DE PROTEINAS DE A. FERROOXIDANS EXPUESTAS A COBRE MEDIANTE LA SEPARACION DE PROTEINAS DE A. FERROOXIDANS EXPUESTAS A COBRE MEDIANTE ELECTRORFORESIS BIDIMENSIONAL EN GELES DE POLIACRILAMIDA. CON ESTE ANALISIS SE OBSERVO QUE LOS NIVELES DE LA PROTEINA RUSTICIANINA (RUS) AUMENTAN DE MANERA IMPORTANTE FRENTE A LA EXPOSICION AL METAL. ESTA PROTEINA PARTICIPA EN EL METABOLISMO ENERGETICO DE A. FERROOXIDANS CUANDO SE CRECE EN ION FERROSO, DONDE REPRESENTA APROXIMADAMENTE EL CINCO POR CIENTO DE LA PROTEINA TOTAL DE LA BACTERIA, Y REQUIERE PARA SU ACTIVIDAD UN ATOMO DE COBRE COMO COFACTOR. SE OBSERVO QUE AL EXPRESAR RUS EN E. COLI, AUMENTABA SU RESISTENCIA A COBRE, FENOTIPO QUE NO SE PRODUCIA SI SE MUTABA ALGUNO DE LOS AMINOACIDOS DEL SITIO DE UNION A COBRE DE LA PROTEINA. DEBIDO A LO ANTERIOR, SE PROPONE QUE RUS PODRIA REPRESENTAR UN IMPORTANTE NUEVO DETERMINANTE DE RESISTENCIA A COBRE EN A. FERROOXIDANS, ADEMAS DE SU PAPEL ENERGETICO. ACTUANDO COMO UNA PROTEINA QUE CAPTA COBRE EN EL ESPACIO PERIPLASMICO DE LA BACTERIA, LO QUE COMBINADO A LOS DEMAS DETERMINANTES DE RESISTENCIA A COBRE DESCRITOS EN ESTA TESIS, PODRIAN DAR CUENTA DE LOS IMPORTANTES NIVELES DE RESISTENCIA A COBRE DE A. FERROOXIDANS. |