| LA FOSFOFRUCTOQUINASA-2 (PFK-2) DE E. COLI TRANSFIERE EFICIENTEMENTE UN GRUPO FOSFATO AL HIDROXILO 1 DE FRUCTOSA-6-P UTILIZANDO MGATP, REACCION CUYA VELOCIDAD ES REGULADA NEGATIVAMENTE MEDIANTE UN SITIO ALOSTERICO PARA MGATP. ANALISIS FILOGENETICOS Y LA RECIENTE OBTENCION DE LA ESTRUCTURA CRISTALOGRAFICA DE LA PFK-2, SITUAN A ESTA ENZIMA ENTRE UN GRUPO DE QUINASAS DE AZUCARES Y VITAMINAS DENOMINADO SUPERFAMILIA DE LA RIBOQUINASA. LAS ENZIMAS REPRESENTANTES DE ESTA SUPERFAMILIA COMPARTEN UN DOMINIO COMUN TIPO ALFA/BETA/ALFA QUE CONTIENE LA MAYORIA DE LOS DETERMINANTES ESTRUCTURALES QUE ORIGINAN EL SITIO ACTIVO. POR OTRA PARTE, ESTUDIOS CRISTALOGRAFICOS, Y EN ALGUNOS CASOS BIOQUIMICOS, HAN DESCRITO A LOS MIEMBRSOS DE ESTA FAMILIA COMO TETRAMEROS, TRIMEROS, DIMEROS Y MONOMEROS QUE PRESENTAN ARREGLOS CUATERNARIOS QUE OCURREN A TRAVES DE DIFERENTES SUPERFICIES DE INTERACCION. EN AUSENCIA DE SUSTRATOS O EN PRESENCIA DE FRUCTOSA-6-P, LA PFK-2 SE HA DESCRITO COMO UN HOMODIMERO DE 66 KDA, CUYA INTERFAZ SE CREA A TRAVES DE ELEMENTOS DE ESTRUCTURA SECUNDARIA ADICIONALES AL DOMINIO CONSERVADO ALFA/BETA/ALFA DE LOS REPRESENTANTES DE LA SUPERFAMILIA DE LA RIBOQUINASA. SIN EMBARGO, EN LA PFK-2 Y EN SUS HOMOLOGOS MAS CERCANOS, NO SE HAN DETERMINADO LAS CARACTERISTICAS ESTRUCTURALES DE SUS SUBUNIDADES AISLADAS Y POR ENDE SE DESCONOCE EL PAPEL DE LA ESTRUCTURA CUATERNARIA EN CUANTO A LA FUNCION Y ESTABILIDAD EN ESTOS TIPOS DE DIMEROS. POR OTRO LADO, LA UNION DE MGATP AL SITIO ALOSTERICO DE LA PFK-2 TIENE COMO RESULTADO LA ASOCIACION DEL DIMERO NATIVO EN TETRAMERO, LO CUAL HA SIDO CORRELACIONADO CON LA INHIBICION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA. LA INHIBICION ALOSTERICA Y EL CONCOMITANTE CAMBIO DE ESTADO DE AGREGACION SON CARACTERISTICAS EXCLUSIVAS PARA LA PFK-2 DE E. COLI, YA QUE HOMOLOGOS CERCANOS CAPACES DE FOSFORILAR OTROS AZUCARES NO PRESENTAN ESTA CARACTERISTICA. DE ESTA FORMA, LA PFK-2 DE E. COLI PRESENTA DOS TIPOS DE INTERFAZ: UNA ESTRUCTURALMENTE CONSERVADA, RELACIONADA CON LA ARQUITECTURA DEL SITIO ACTIVO Y OTRA NO CONSERVADA, RELACIONADA CON LA REGULACION ALOSTERICA DE SU ACTIVIDAD CATALITICA. EN ESTA TESIS SE PERTURBO LA ESTRUCTURA DE LA PFK-2 MEDIANTE LA UTILIZACION DE AGENTES CAOTROPICOS, TEMPERATURA Y MUTAGENESIS SITIO DIRIGIDA, CON EL PROPOSITO DE CONOCER EL PAPEL DE LAS INTERACCIONES CUATERNARIAS EN LA ESTABILIDAD DE LA ENZIMA, CATALISIS ENZIMATICA Y REGULACION ALOSTERICA. EL DESPLEGAMIENTO DE LA PFK-2 INDUCIDO POR GDNHCI SE DETERMINO MEDIANTE MEDIDAS DE ACTIVIDAD ENZIMATICA, FLUORESCENCIA INTRINSECA, DICROISMO CIRCULAR, CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION Y DISPERSION DINAMICA DE LUZ, PARA CARACTERIZAR LOS CAMBIOS CONFORMACIONALES INVOLUCRADOS EN LA DISOCIACION Y DESPLEGAMIENTO DE LA ENZIMA. EL TRATAMIENTO CON GDNHCI DE LA CONFIGURACION DIMETRICA DE LA PFK-2 MOSTRO LA PRESENCIA DE UN INTERMEDIARIO INACTIVO CON PROPIEDADES FLUORESCENTES SIMILARES AL ESTADO DESPLEGADO, PERO QUE RETIENE ALREDEDOR DE UN 30 POR CIENTO DE LA SEÑAL DE DICROISMO CIRCULAR CORRESPONDIENTE AL DIMERO NATIVO. PARA EVALUAR EL ESTADO DE AGREGACION DEL INTERMEDIARIO, SE DETERMINO EL EFECTO DE LA CONCENTRACION DE PROTEINA EN LAS TRANSICIONES QUE LO ORIGINAN, CON EL FIN DE DETECTAR LOS CAMBIOS CONFORMACIONES ACOPLADOS A LA DISOCIACION DE LAS SUBUNIDADES DE LA PFK-2. ESTA APROXIMACION EXPERIMENTAL, JUNTO A EXPERIMENTOS DE CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION Y DISPERSION DINAMICA DE LUZ, INDICA QUE EL INTERMEDIARIO CORREPONDE A UN MONOMERO EXPANDIDO CON UN RADIO HIDRODINAMICO DE 38 A, LO QUE EQUIVALE A UN RADIO HIDRODINAMICO 12 A MAYOR QUE EL CALCULADO PARA UN MONOMERO COMPACTO DE 33 KDA (EL TAMAÑO DE LA SUBUNIDAD DE LA PFK-2). ESTOS RESULTADOS PERMITIERON PROPONER UN MECANISMO MINIMO PARA EL DESPLEGAMIENTO DE LA PFK-2 REPRESENTADO POR EL SIGUIENTE MODELO, N2 2I 2U DONDE N2 REPRENTA EL DIMERO NATIVO, I ES EL INTERMEDIARIO MONOMETRICO Y U ES EL ESTADO DESPLEGADO DE LA ENZIMA. EL AJUSTE DE ESTEMODELO A LAS TRANSICIONES CONFORMACIONALES OBSERVADAS EN PRESENCIA DE GDNHCI, INDICO QUE LOS CAMBIOS CONFORMACIONALES QUE OCURREN EN LA TRANSICION N2 2I DAN CUENTA DEL 75 POR CIENTO DE LA ESTABILIDAD DEL DIMERO NATIVO N2 RESPECTO AL ESTADO DESPLEGADO. POR LO TANTO, SE POSTULA QUE LA PERDIDA DE ESTRUCTURA CUATERNARIA INDUCIDA POR GDNHCI, ES UN PROCESO QUE NO PUEDE DIFERENCIARSE DE LA PERDIDA DE UNA PARTE IMPORTANTE DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DE LAS SUBUNIDADES. POR OTRA PARTE, EL DESPLEGAMIENTO DE LA PFK-2 A PARTIR DE SU CONFIGURACION TETRAMERICA, OBTENDIDA EN PRESENCIA DE MGATP, MOSTRO LA FORMACION DE UN INTERMEDIARIO TETRAMERICO QUE SE CARACTERIZO POR PRESENTAR UN ESPECTRO DE FLUORESCENCIA ALTERADO RESPECTO AL TETRAMERO NATIVO. LA DISOCIACION DEL TETRAMERO TRANSCURRE EN UN ESTRECHO INTERVALO DE AGENTE CAOTROPICO SIN UNA CLARA PRUEBA DE LA ACUMULACION DE DIMEROS O MONOMEROS COMPACTOS. POR EL CONTRARIO, SOLO SE OBSERVA LA ACUMULACION DE UN INTERMEDIARIO MONOMERICO DESESTRUCTURADO CON PROPIEDADES SIMILARES AL ANTERIORMENTE DESCRITO. ESTOS RESULTADOS INDICAN QUE LOS MONOMEROS AISLADOS DE LA PFK-2 NO SON ESTABILIZADOS POR LA UNION DE MGATP AL SITIO ALOSTERICO. CON EL FIN DE ESTUDIAR LAS PROPIEDADES ESTRUCTURALES DEL MONOMERO EN AUSENCIA DE GDNHCL, SE PERTURBO LA INTERFAZ MONOMERO-MONOMERO DE LA PFK-2 MEDIANTE EL CAMBIO DE L93 POR ALANINA. LA MUTANTE SE CARACTERIZO COMO UN MONOMERO INACTIVO, CON UN MAYOR GRADO DE ESTRUCTURA SECUNDARIA Y 9 A MAS COMPACTO QUE EL INTERMEDIARIO MONOMERICO OBTENIDO EN PRESENCIA DE GDNHCL. NO OBSTANTE, EN COMPARACION CON SU CONFORMACION ASOCIADA LA MUTANTE PRESENTO UNA IMPORTANTE PERDIDA DE ESTRUCTURA SECUNDARIA. EN CONDICIONES DONDE LA MUTANTE SE ENCUENTRA DISOCIADA, EL AUMENTO DE LA TEMPERATURA Y EL TRATAMIENTO CON GDNHCI, MOSTRARON QUE ESTA ESPECIE PRESENTA UNA ESTABILIDAD MARGINAL YA QUE LA PERDIDA DE SU ESTRUCTURA SECUNDARIA NO ORIGINA TRANSICIONES SIGMOIDES COMO LAS OBTENIDAS A PARTIR DE SU CONFIGURACION DIMERICA. EN CONJUNTO ESTOS RESULTADOS INDICAN QUE LAS SUBUNIDADES AISALADAS DE LA PFK-2 CARECEN DE INTERACCIONES TERCIARIAS, LAS QUE SOLO SE ESTABLECEN CUANDO LA ENZIMA ADQUIERE SU ESTRUCTURA CUATERNARIA. EL PAPEL DE LA INTERFAZ DIMERO-DIMERO EN LA REGULACION ALOSTERICA DE LA PFK-2 SE ANALIZO MEDIANTE LA CARACTERIZACION CINETICA Y LA CAPACIDAD DE FORMAR TETRAMEROS DE UNA SERIE DE MUTANTES ORIGINADAS POR LA MEMOCION SISTEMATICA DE RESIDUOS Y SEGMENTOS DEL EXTREMO CARBOXILO TERMINAL DE LA ENZIMA. ESTAS MUTANTES SE CONSTRUYERON DEBIDO A QUE EXPERIMENTOS DE PROTEOLISIS LIMITADA SUGERIAN QUE EL EXTREMO CARBOXILO TERMINAL DE LA ENZIMA PODRIA CONTENER RESIDUOS QUE PARTICIPAN EN LA FORMACION DEL TETRAMERO. SE ENCONTRO QUE LA REMOCION DE SEGMENTOS DEL EXTREMO CARBOXILO TERMINAL DE LA PFK-2, PRODUCE ENZIMAS CON UNA PSEUDO-AFINIDAD DISMINUIDA (ELEVADAS KM APARENTES) PARA MGATP Y NO FORMAN TETRAMEROS EN PRESENCIA DEL NUCLEOTIDO. A PARTIR DE ESTA INFORMACION SE GENERARON DOS MUTANTES PUNTUALES DEL EXTREMO CARBOXILO TERMINAL, CON EL FIN DE AFECTAR SEPARADAMENTE EL AUMENTO DE LA KM APARENTE PARA MGATP DE LA FALLA EN LA FORMACION DE TETRAMEROS. LA MUTANTE Y306A MOSTRO PARAMETROS CINETICOS Y UN PATRON DE INHIBICION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA IDENTICO A LOS DE LA ENZIMA SILVESTRE, PERO NO PRESENTO CAMBIOS EN EL ESTADO DE AGREGACION EN PRESENCIA DEL NUCLEOTIDO. POR OTRA PARTE, LA MUTANTE L307A PRESENTO EL MISMO COMPORTAMIENTO CINETICO Y ESTADO DE AGREGACION EN PRESENCIA DEL NUCLEOTIDO QUE LAS MUTANTES QUE RESULTARON AL REMOVER SEGMENTOS DEL EXTREMO CARBOXILO TERMINAL. ESTOS RESULTADOS INDICAN QUE LA FORMACION DE TETRAMEROS NO ES REQUISITO PARA LA REGULACION ALOSTERICA DE LA PFK-2. |