| LOS TEJIDOS EPITELIALES MANTIENEN UNA BARRERA DE PERMEABILIDAD ENTRE EL ORGANISMO Y SU ENTORNO DEBIDO A QUE LAS CELULAS QUE LOS CONFORMAN ESTABLECEN UNIONES ESTRECHAS ENTRE ELLAS. ESTAS CELULAS POSEEN SU SUPERFICIE DIVIDIDA EN LOS POLOS APICAL Y BASOLATERAL AL QUE DESTINAN SELECTIVAMENTE PROTEINAS. EN LA RUTA SECRETORIA, LAS PROTEINAS SON TRANSPORTADAS HASTA EL TGN, DONDE SON SEGREGADAS Y EMPACADAS EN VESICULAS HACIA LA MP APICAL O BASOLATERAL. LAS PROTEINAS DEMEMBRANA BASOLATERALES PRESENTAN SEÑALES DE DESTINACION PEPTIDICAS PRESENTES SIEMPRE EN SUS DOMINIOS CITOSOLICOS, LA MAYORIA BASADAS EN EL AMINOACIDO TIROSINA. LA FAMILIA DE COMPLEJOS ADAPTADORES AP (AP1-4) FORMAN PARTE DE LA MAQUINARIA CITOSOLICA QUE RECONOCE ESTAS SEÑALES Y ACOPLAN A LAS PROTEINAS CARGA A LOS SISTEMAS FORMADORES DE VESICULAS. ESTOS COMPLEJOS HETEROTERAMEROS, QUE FUNCIONARIAN EN DISTINTAS RUTAS DE TRANSPORTE, ESTAN COMPUESTOS POR DOS SUBUNIDADES GRANDES (Y/ALFA/BETA/E Y BETA1-4), UNA MEDIANA (U 1-4) Y UN APEQUEÑA (O 1-4), SIENDO LA SUBUNIDAD U LA QUE POSEE UN BOLSILLO DE RECONOCIMIENTO PARA SEÑALES TIROSINA. EL COMPLEJO ADAPTADOR AP1B, DE EXPRESION EPITELIAL, SEGREGA UN CONJUNTO DE PROTEINAS HACIA LA SUPERFICIE BASOLATERAL. HEMOS DESCRITO UN ANTICUERPO ANTI-U 1BN CON EL CUAL HEMOS DEMOSTRADO QUE AP1B FUNCIONA EN ENDOSOMAS DE RECICLAJE SEGREGANDO PROTEINAS HACIA LA SUPERFICIE BASOLATERAL, EN LA RUTA BIOSINTETICA (P.E. VSVG) O EN LA RUTA DE RECICLAJE (P.E. LDLR). �COMO SON SEGREGADAS LAS PROTEINAS DE SECRECION BASOLATERAL? ESTAS PROTEINAS SOLUBLES NO POSEEN DOMINIOS CITOSOLICOS QUE PRESENTEN SEÑALES QUE PUEDAN SER RECONOCIDAS POR LOS ADAPTADORES CITOSOLICOS. SE HA ESPECULADO QUE PODRIAN UTILIZAR UN RECEPTOR-SEGREGADOR TRANSMEMBRANA, SIN EMBARGO, NO EXISTE EVIDENCIA QUE AVALE SU EXISTENCIA. EN ESTA TESIS HEMOS POSTULADO QUE SI EL RECEPTOR-SEGREGADOR EXISTE POSIBLEMENTE UTILICE LA MAQUINARIA DE ADAPTADORES CITOSOLICOS QUE RECONOCE TIROSINA, DEBIDO A QUE ESTAS SON LAS SEÑALES MAS FRECUENTEMENTE ENCONTRADAS. MEDIANTE UNA ESTRATEGIA QUE COMBINA CULTIVOS EPITELIALES POLARIZADOS EN FILTROS DE POLICARBONATO CON EXPERIMENTOS DE PULSO Y CAZA PUDIMOS EVALUAR LA SECRECION BIOSINTETICA DE LA PROTEINA DE TRANSMEMBRANA E-CADERINA Y PROTEINAS DE SECRECION BASOLATERAL (FIBRONECTINA Y OTRAS). LA FIBRONECTINA FUE SECRETADA POR UN MECANISMO ACTIVO QUE DEPENDE DE MICROTUBULOS, DISTINTO DEL QUE UTILIZA LA PROTEINA DE TRANSMEMBRANA, E -CARDERINA. SOBRE ESTE SISTEMA EVALUAMOS EL EFECTO DE PEPTIDOS MEMBRANA-PERMEANTES CONTENIENDO SEÑALES DE DESTINACION BASOLATERAL PARA INTERFERIR CON LA MAQUINARIA CITOSOLICA DE SEGREGACION DE PROTEINAS QUE RECONOCE SEÑALES TIROSINA. UTILIZAMOS UN PEPTIDO CON LA SEÑAL DE LA PROTEINA VSVG QUE INHIBE EL TRANSPORTE AP1B DEPENDIENTE Y OTRO QUE CONTIENE LA SEÑAL DEL LDLR QUE INHIBIO EL TRANSPORTE DEL LDLR, AP1B INDEPENDIENTE. LA SECRECION BASOLATERAL DE LA FIBRONECTINA Y OTRAS PROTEINAS SE INHIBIO HASTA EN UN 70 POR CIENTO AL INTERFERIR LA RUTA BIOSINTETICA QUE SEGREGA AL LDLR. ESTA SECRECION NO SE INHIBIO ESPECIFICAMENTE AL TRATAR CON EL PEPTIDO CON LA SEÑAL DE LA VSVG QUE INTERFIERE CON LA RUTA DEL COMPLEJO ADAPTADOR EPITELIAL AP1B. ESTA SE CONVIERTE EN UNA PRIMERA EVIDENCIA DE LA EXISTENCIA DE UN RECEPTOR-SEGREGADOR PARA LAS PROTEINAS DE SECRECION BASOLATERAL, DEMOSTRANDO QUE UN CONJUNTO DE PROTEINAS DE SECRECION UTILIZAN LOS ADAPTADORES CITOSOLICOS QUE SEGREGAN AL LDLR EN SU RUTA BIOSINTETICA BASOLATERAL. NUESTRO MODELO PLANTEA QUE ESTE RECEPTOR ESTARIA RECONOCIENDO A CIERTAS PROTEINAS DE SECRECION EN SU DOMINIO LUMINAL, POSIBLEMENTE MEDIANTE UNA INTERACCION SENSIBLE A PH Y SU DOMINIO CITOSOLICO EXPONDRIA UNA SEÑAL DE DESTINACION BASOLATERAL BASADA EN TIROSINA QUE SERIA RECONOCIDA Y SEGREGADA POR LA AUN DESCONOCIDA MAQUINARIA DE ADAPTADORES QUE SEGREGA AL LDLR. UNA PROYECCION DE ESTA TESIS ES LA IDENTIFICACION ESTE RECEPTOR. EN ESTA TESIS TAMBIEN ABORDAMOS EL ESTUDIO DEL ENSAMBLAJE DE LOS COMPLEJOS AP1. EN NUESTRO LABORATORIO HEMOS DESCRITO EL UNICO ANTICUERPO QUE RECONOCE A LA PROTEINA U1B ENDOGENA POR INMUNOFLUORESCENCIA Y QUE ADEMAS RESULTO BLOQUEAR LA FUNCION DEL ADAPTARDOR AP1B. SIN EMBARGO EL ANTICUERPO RECONOCE Y BLOQUEA LA FUNCION DE LA U1B EN CELULAS FRT, PERO NO EN CELULAS MDCK, Y ESTA DIFERENCIA NO PUEDE EXPLICARSE POR DIFERENCIAS EN LA SECUENCIA DEL EPITOPE EN LOS DISTINTOS TIPOS CELULARES. HIPOTETIZAMOS QUE LAS DIFERENCIAS OBSERVDAS EN EL RECONOCIMIENTO DEL ANTI-U1BN SE DEBEN A DIFERENCIAS EN EL ENSAMBLAJE DEL COMPLEJO AP1, QUE EXPONE EL EPITOPE EN CELULAS FRT, PERO NO EN MDCDK, NUESTRA ESTRATEGIA PARA ESTUDIAR EL ENSAMBLAJE DE LOS COMPLEJOS AP1 INCLUYO EXPERIMENTOS DE PULSO Y CAZA E INMUNOPRECIPITACION NATIVA DE AP1 CON ANTICUERPOS COMERCIALES ANTI- Y Y CON ANTICUERPOS ANTI-BETA1 QUE GENERAMOS PARA ESTE FIN. DEMOSTRAMOS QUE EL ENSAMBLAJE DE LOS COMPLEJOS AP1 INVOLUCRA LA EXISTENCIA DE HETERODIMEROS Y/O1 Y BETA1/U1 PRE-FORMADOS QUE ANTECEDEN A LOS COMPLEJOS AP1 TETRAMERICOS. ESTOS DIMEROS FUERON DETECTABLES EN CELULAS FRT PERO NO EN CELULAS MDCK, DEBIDO A QUE EL ENSAMBLAJE PRESENTA UN RETRASO DE VARIAS HORAS EN CELULAS FRT EN COMPARACION CON CELULAS MDCK EN LAS QUE EL COMPLEJO AP1 SE ARMA INMEDIATAMENTE DESPUES DE LA SINTESIS DE SUS SUBUNIDADES. LA DETECCION DE HETERODIMEROS BETA1/U1 EN CELULAS FRT EXPLICARIA LA REACTIVIDAD POSITIVA DEL ANTICUERPO ANTI-U1B, YA QUE EL CRISTAL DE AP1 PREDICE EN QUE EL EPITOPE EN U1B ESTARIA EXPUESTO Y ACCESIBLE A ANTICUERPO SEN LOS DIMEROS BETA1/U1, PERO NO EN EL COMPLEJO AP1. ADEMAS, EL HECHO QUE EL ANTI-U 1BN TENGA FUNCIONES BLOQUEANTES DE LA FUNCION DE AP1B ABRE LA POSIBILIDAD DE QUE LOS DIMEROS BETA1/U1 SEAN FUNCIONALES, HIPOTESIS QUE QUEDA POR SER EXPLORADA. TAMBIEN DEMOSTRAMOS QUE EXISTE UNA REGULACION ACTIVA DEL ENSAMBLAJE DE LOS COMPLEJOS AP1. LA DEPLECION DE ATP INHIBE EL ENSAMBLAJE DEL COMPLEJO EN CELULAS MDCK, EFECTO QUE SE REVIERTE AL LAVAR EL TRATAMIENTO. NUNCA ANTES SE HABIA PROPUESTO EL ENSAMBLAJE REGULADO DE NINGUN COMPLEJO AP. ESTA EVIDENCIA ABRE UN CAMPO DE POSIBILIDADES EN LA REGULACION DEL ENSAMBLAJE QUE DA CUENTA DE LA PARTICIPACION NUEVOS ELEMENTOS REGULADORES, POSIBLEMENTE UNA CHAPERONAño UNA PROTEINA QUINASA, ALTERNATIVAS QUE QUEDAN POR SER ANALIZADAS. ESTE ELEMENTO REGULADOR PODRIA SER EL QUE EXPLIQUE LAS DIFERENCIAS OBSERVADAS EN EL ENSAMBLAJE ENTRE CELULAS MDCK Y FRT. |