MODIFICACION DE LA EXPRESION GENICA DEL GEN OPR3 INVOLUCRADO EN LA BIOSINTESIS DE ACIDO JASMONICO EN VID Y SU EFECTO SOBRE LA RESPUESTA DEFENSIVA FRENTE A DAÑO MECANICO E INFECCION POR BOTRYTIS CINEREA.
Autor	VICTOR ALEJANDRO POLANCO CASTRO
Profesor guía	HUGO PEÑA CORTES
Para optar al grado de	DOCTOR EN BIOTECNOLOGIA.	Institución	PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE VALPARAISO. UNIVERSIDAD TECNICA FEDERICO SANTA MARIA.
Lugar	VALPARAISO, CHILE	Año	2008
Páginas	96p.
Disciplina	BIOTECNOLOGIA.	Colección
Ubicación	TESIS/0703D
Resumen
EL ACIDO JASMONICO (AJ) REPRESENTA A UN TIPO DE HORMONA VEGETAL, QUE PARTICIPA COMO UNA MOLECULA SEÑAL ENCARGADA DE REGULAR EL CRECIMIENTO Y DESARROLLO VEGETAL, COMO TAMBIEN LA RESPUESTA DEFENSIVA DE PLANTAS FRENTE A MULTIPLES CONDICIONES DE ESTRES MEDIOAMBIENTAL. ESTUDIOS RECIENTES HAN DEMOSTRADO QUE LA APLICACION EXOGENA DE AJ O SU DERIVADO METIL JASMONATO (MEAJ) SOBRE PLANTAS DE VID SON CAPACES DE INDUCIR UN AUMENTO EN EL GRADO DE RESISTENCIA EN ESTAS PLANTAS FRENTE AL ATAQUE DE ARTROPODOS Y PATOGENOS VEGETALES. SIN EMBARGO, A PESAR DEL ENORME POTENCIAL BIOTECNOLOGICO QUE MUESTRAN ESTAS MOLECULAS EN LA PROTECCION DE DIFERENTES CULTIVARES, INCLUIDA LA VID, EL ROL IN VIVO DE AJ EN LA DEFENSA DE ESTOS VEGETALES, ES AUN DESCONOCIDO. EL AJ ES SINTETIZADO A PARTIR DEL ACIDO LINELENICO A TRAVES DE LA PARTICIPACION DE DIFERENTES ENZIMAS, SIENDO LA REACCION CATALIZADA POR LA 12-OXOFITODIENOATO REDUCTASA 3 (OPR3) UNO DE LOS PASOS CLAVES EN LA REGULACION DE SU BIOSINTESIS. EN ESTE TRABAJO DE TESIS, SE EVALUO SI LA MODIFICACION DE LA EXPRESION GENICA DE LA ENZIMAñoPR3 PODIAN MODULAR LA BIOSINTESIS DE JA Y COMO ESTA MODIFICACION PODIA AFECTAR LA RESPUESTA A DAÑO MECANICO Y BOTRYTIS CINEREA. PARA ESTE EFECTO, SE DESARROLLARON PLANTAS TRANSGENICAS DE VID MEDIANTE EMBRIOGENESIS SOMATICA (VITIS VINIFERA CV THOMPSON SEEDLESS) UTILIZANDO TECNOLOGIAS DE ARN-ANTISENTIDO Y SOBREEXPRESION GENICA. TRES LINEAS TRANSGENICAS "ARN-ANTISENTIDO" DE VID, L35, L39 Y L65, LAS CUALES EXPRESAN UN FRAGMENTO DE LA REGION CODIFICANTE (ADNC) DEL GEN OPR3 DE VID (VVOPR3) EN DIRECCION ANTISENTIDO CON RESPECTO AL PROMOTOR 35S DEL VIRUS DEL MOSAICO DE LA COLIFLOR (CAMV), PRESENTARON UNA EFICIENTE INHIBICION EN LA EXPRESION DEL GEN ENDOGENO WWOPR3 DE 80, 82 Y 95 POR CIENTO RESPECTIVAMENTE. ESTAS LINEAS MOSTRARON NIVELES DE AJ Y SUS INTERMEDIARIOS, OPDA Y DNOPDA, ALTERADOS POR EL EFECTO DEL DAÑO MECANICO, LOS QUE CORRELACIONAN CON EL GRADO DE SILENCIAMIENTO GENETICO DE VVOPR3. EL ANALISIS DE LA EXPRESION DE GENES QUE NORMALMENTE SON INDUCIDOS POR HERIDA MECANICA Y POR EL HONGO BOTRYTIS CINEREA INDICARON QUE EXISTE UNA REDUCCION EN LA EXPRESION DE GENES ASOCIADOS A LA DEFENSA VEGETAL, TALES COMO ALENO OXIDO SINTASA (AOS), POLIFENOL OXIDASA (PPO), PROTEINA INHIBIDORA DE PROTEINASAS (PIN) Y PROTEINA INHIBIDORA DE POLIGALACTURONASA (PGIP). LOS RESULTADOS OBTENIDOS DESDE EL ANALISIS DE LAS LINEAS ARN-ANTISENTIDO DE VID, SUGIEREN QUE EL GEN VVOPR3 TENDRIA UNA IMPORTANTE FUNCION EN LA SINTESIS DEL ISOMERO DE AJ BIOLOGICAMENTE ACTIVO Y POR ENDE, SOBRE LA EXPRESION DE GENES DEFENSIVOS. PARA LA GENERACION DE PLANTAS TRANSGENICAS DE VID QUE SOBREEPRESEN EL GEN OPR3, SE UTILIZO UNA SECUENCIA DE ADNC HETEROLOGIA A LA VID QUE CODIFICA PARA LAñoPR3 DE TOMATE (LEOPR3). COMO RESULTADO DE LA TRANSFORMACION GENETICA DE VID CON LA CONSTRUCCION QUIMERICA QUE SOBREEXPRESA EL GEN LEOPR3 (PBINAR-LEOPR3), FUERON GENERADAS 83 POSIBLES LINEAS EXPERIMENTALES. EL ANALISIS DE ESTAS LINEAS EXPERIMENTALES FUE REALIZADO MEDIANTE AMPLIFICACION POR PCR Y NORTHERN BLOT, EL CUAL DEMOSTRO QUE NINGUNA PLANTA TENIA INTEGRADO EL ADN-T EN EL GENOMA DE LA VID Y POR ENDE, NO FUE POSIBLE DETECTAR LA ACUMULACION DE TRANSCRITOS LEOPR3 EN HOJAS DE VIDES. POR TAL MOTIVO, SE DEDUJO QUE EL FALTA DE WCISTO EN LA GENERACION DE PLANTAS TRANSGENICAS DE VID PODRIA SER DEBIDA A; (I) PROBLEMAS EN LA CONSTRUCCION QUIMERICA PBINAR-LEOPR3 QUE IMPIDA LA EFECTIVA INTEGRACION DE LA REGION DEL ADN-T AL GENOMA DE LA VID. PARA RESOLVER DICHAS DEDUCCIONES FUE EVALUADA LA CONSTRUCCION QUIMERICA PBINAR-LEOPR3 A TRAVES DE LA TRANSFORMACION GENETICA DE TABACO, UTILIZANDO UNA ESTRATEGIA DE ORGANIGENESIS SOMATICA. LAS PLANTAS TRANSGENICAS DE TABACO FUERON CAPACES QUE ACUMULAR CONSTITUTIVAMENTE TRANSCRITOS LEOPR3 Y MOSTRAR UN INCREMENTO ADICIONAL EN LOS NIVELES DE AJ DESPUES DE EFECTUADO EL DAÑO MECANICO. ESTOS RESULTADOS DEMOSTRARON QUE LA CONSTRUCCION QUIMERICA PBINAR-LEOPR3 FUE CORRECTAMENTE DISEÑADA Y QUE ES INCOMPARABLE PARA LA TRANFORMACION GENETICA DE VID MEDIANTE EMBRIOGENESIS SOMATICA. LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN ESTE ESTUDIO CONFIRMAN EL ROL REGULATORIO DEL GEN QUE CODIFICA PARA LA ENZIMAñoPR3 EN LA BIOSINTESIS DE AJ EN PLANTAS DE VID Y TABACO, ASI COMO SU INFLUENCIA EN LA EXPRESION DE GENES IMPLICADOS EN LA RESPUESTAS DE PLANTAS A DAÑO MECANICO E INFECCION POR BOTRYTIS CINEREA.