| LA HIDROCEFALIA CONGENITA ES UNA CONDICION PATOLOGICA DEL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL (SNC) CARACTERIZADA POR LA ACUMULACION INTRACRANEAL DE LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO Y LA DILATACION DEL SISTEMA VENTRICULAR. DURANTE EL DESARROLLO EMBRIONARIO TEMPRANO, LA REGION LUMINAL DE LAS PAREDES DEL SISTEMA VENTRICULAR (ZONA VENTRICULAR) ESTA FORMADA FUNDAMENTALMENTE POR CELULAS TRONCALES (NEUROEPITELIO/GLIA RADIAL); EN LOS ESTADIOS AVANZADOS DEL DEARROLLO EMBRIONARIO, CELULAS EPENDIMARIAS INMADURAS COMIENZAN A POBLAR LA ZONA VENTRICULAR, Y FINALMENTE, DURANTE LOS PRIMEROS DIAS POSTNATALES, LA MAYOR PARTE DE LAS PAREDES VENTRICULARES ESTAN CUBIERTAS POR CELULAS EPENDIMARIAS MADURAS. ESTUDIOS EN CASOS DE HIDROCEFALIA CONGENITA HUMANA Y EN MODELOS ANIMALES DE HIDROCEFALIA HEREDITARIA, HAN DEMOSTRADO LA FRECUENTE ASOCIACION ENTRE (I) EL PROCESO HIDROCEFALICO Y (II) LA PERDIDA (DENUDAMIENTO) DEL NEUROEPITELIO/EPENDIMO. TRADICIONALMENTE, LA PERDIDA DE ESTAS CELULAS HA SIDO CONSIDERADA SECUNDARIA A LA DILATACION E HIPERTENSION INTRAVENTRICULAR. EVIDENCIAS OBTENIDAS EN LOS ULTIMOS AÑOS EN NUESTRO LABORATORIO, A PARTIR DE ESTUDIOS EN EL RATON MUTANTE HYH (HYDROCEPHALUS-HOP GAIT), DESAFIAN ESTA CONCEPCION NETAMENTE MECANICA Y SUGIEREN FUERTEMENTE QUE EL DENUDAMIENTO DEL NEUROEPITELIO/EPENDIMO PRECEDE Y GATILLA EL DESARROLLO DE LA HIDROCEFALIA. EL RATON MUTANTE HYH PRESENTA UNA MUTACION PUNTUAL EN EL GEN NAPA QUE CODIFICA PARA LA PROTEINA ALFA-SNAP (SOLUBLE N-ETHYLMALEIMIDE SENSITIVE FACTOR (NSF) ATTACHMENT PROTEIN ALPHA). ESTA MUTACION RESULTA EN LA SUSTITUCION DE LA METIONINA 105 POR UNA ISOLEUCINA (M105I). ALFA-SNAP SE EXPRESA EN LA MAYORIA DE LOS TEJIDOS Y ES UN FACTOR CLAVE, JUNTA LA ATPASA NSF, DE LA MAQUINARIA GENERAL DE FUSION DE MEMBRANAS MEDIADA POR SNARES (NAP RECEPTORS) QUE PARTICIPA EN EL TRAFICO VESICULAR DE PROTEINAS ENTRE COMPARTIMIENTOS INTRACELULARES Y HACIA LA MEMBRANA PLASMATICA. EN ESTE CONTEXTO, �POR QUE LA MUTACION DE UNA PROTEINA CON UNA DISTRIBUCION SUPUESTAMENTE UBICUA PROVOCA ALTERACIONES ESPECIFICAS DEL DESARROLLO DEL SNC?, �CUAL ES EL MECANISMO CELULAR Y MOLECULAR QUE VINCULA LA MUTACION DE ALFA-SNAP CON EL DENUDAMIENTO NEUROEPITELIAL/EPENDIMARIO?. LAS PROTEINAS QUE PARTICIPAN EN LOS MEDIOS DE UNION ENTRE LAS CELULAS DEL NEUROEPITELIO/GLIA RADIAL/EPENDIMO, SON POTENCIALES CANDIDATOS A ESTAR INVOLUCRADOS EN EL DENUDAMIENTO DEL NEUROEPITELIO/EPENDIMO. DIFERENTES EXPERIMENTOS SUGIEREN QUE LAS UNIONES INTERCELULARES SON CLAVES PARA LA ESTABILIDAD ESTRUCTURAL DE LA ZONA VENTRICULAR Y EL DESARROLLO NORMAL DEL SNC. DURANTE GRAN PARTE DEL DEARROLLO EMBRIONARIO Y POSTNATAL, LAS CELULAS QUE RECUBREN LA SUPERFICIE VENTRICULAR ESTAN UNIDAS POR UNIONES TIPO ZONULA ADHERENTE. LAS ZONULAS ADHERENTES ESTAN CONSTITUIDAS POR UN COMPLEJO PROTEICO QUE INCLUYE PROTEINAS TRANSMEMBRANA QUE ESTABLECEN UNIONES HOMOFILICAS DEPENDIENTES DE CALCIO CONOCIDAS COMO CADHERINAS. N-CADHERINA ES ALTAMENTE EXPRESADA EN EL NEUROEPITELIO/EPENDIMO. �PRESENTAN LOS RATONES HYH UNA DEFICIENCIA EN EL TRAFICO DE PROTEINAS DE ADHESION INTERCELULAR (CADHERINAS)?; �ALTERACIONES EN LAS UNIONES ADHERENTES DEL NEUROEPITELIO/EPENDIMO PODRIAN GATILLAR SU DENUDAMIENTO? EL PRESENTE TRABAJO PRETENDE RESPONDER LAS PREGUNTAS PLANTEADAS, PONIENDO A PRUEBA LA HIPOTESIS QUE LA MUTACION DE ALFA-SNAP EN LOS RATONES HYH CONDUCE A UNA LATERACION EN EL TRAFICO DE CADHERINAS Y FORMACION DE UNIONES ADHERENTES ANOMALAS EN EL NEUROEPITELIO/EPENDIMO, GATILLANDO SU DENUDAMIENTO. PARA ELLO, SE PLANTEO: (I) INVESTIGAR LA EXPRESION TEMPORAL Y ESPACIAL, Y LA FUNCIONALIDAD DE ALFA-SNAP EN RATONES WILD TYPE Y MUTANTES HYH, Y (2) INVESTIGAR LA CONFORMACION Y LA FUNCIONALIDAD DE LAS UNIONES ADHERENTES DEL NEUROEPITELIO/EPENDIMO DE RATONES WILD TYPE Y MUTANTES HYH. PARA PODER LLEVAR A CABO ESTOS OBJETIVOS, SE DESARROLLO EN PRIMER LUGAR, UN METODO DE GENOTIPIFICACION DE LOS RATONES HYH BASADO EN LA CREACION DE UN SITIO DE RESTRICCION ARTIFICIAL MEDIANTE MUTAGENESIS SITIO-DIRIGIDA EN PCR. EL ANALISIS DE LA EXPRESION DE ALFA-SNAP EN ANIMALES WILD TYPE MEDIANTE WESTERN BLOT E INMUNOCITOQUIMICA, PERMITIO DETERMINAR (I) QUE ALFA-SNAP SE EXPRESA PREFERENCIALMENTE EN EL SNC Y DURANTE ESTADIOS EMBRIONARIOS, PRESENTANDO VARIACIONES TEMPORALES Y REGIONALES EN LOS NIVELES DE EXPRESION DENTRO DEL SNC, Y (II) DURANTE EL DESARROLLO EMBRIONARIO Y EN LOS PRIMEROS DIAS POSTNATALES, LA INMUNORREACCION PARA ALFA-SNAP SE LOCALIZA FUNDAMENTALMENTE EN LA REGION APICAL DEL NEUROEPITELIO/EPENDIMO. POR OTRO LADO, LOS RATONES HYH, PRESENTARON UNA REDUCCION SIGNFICATIVA EN LOS NIVELES DE ALFA-SNAP EN DIFERENTES ORGANOS, SIENDO CEREBRO EL ORGANO QUE PRESENTO LA MAYOR REDUCCION. LA REDUCCION EN LOS NIVELES DE ALFA-SNAP SE ACOMPAÑO DE UN AUMENTO EN LOS NIVELES DE NSF. ADEMAS DE LA REDUCCION EN LOS NIVELES DE ALFA-SNAP, SE OBSERVO QUE LOS RATONES HYH PRESENTAN UNA DISTRIBUCION SUBCELULAR ANOMALA DE ESTA PROTEINA. MEDIANTE FRACCIONAMIENTO DE EXTRACTOS PROTEICOS DE CEREBRO, SE DETERMINO QUE LOS MUTANTES HYH PRESENTAN UNA MENOR PROPORCION DE ALFA-SNAP UNIDA A MEMBRANAS. ESTA APARENTE DISFUNCION DE LA PROTEINA MUTADA FUE CONFIRMADA EN ENSAYOS FUNCIONALES EN CONTECTO CELULAR. SE UTILIZO EL MODELO DE REACCION ACROSOMAL EN ESPERMATOZOIDES INTACTOS Y PERMEABILIZADOS PARA EVALUAR LA FUNCIONALIDAD DE LA PROTEINA MUTADA ALFA-SNAP(M105I); DEMOSTRANDO QUE LOS ESPERMATOZOIDES HYH PRESENTAN UNA REDUCCON EN LOS INDICES DE EXOCITOSIS ACROSOMAL QUE PUEDE SER RECUPERADA CON LA ADICION DE ALFA-SNAP(WILL TYPE) EXOGENA PERO NO CON ALFA-SNAP(M105I). INCLUSO, ALFA-SNAP(M105I) ES INHIBITORIA EN ENSAYOS DE REACCION ACROSOMAL EN ESPERMATOZOIDES DE RATONES WILD TYPE Y DE DONANTES HUMANOS NORMALES. ESTUDIOS MEDIANTE MICROSCOPIA ELECTRONICA DE TRANSMISION, INMUNOCITOQUIMICA, E INMUNOFLUORESCENCIA/MICROSXOPIA CONFOCAL, PERMITIERON CONFIRMAR QUE DURANTE EL DESARROLLO EMBRIONARIO (NEUROEPITELIO/GLIA RADIAL) Y POSTNATAL TEMPRANO (EPENDIMO INMADURO/EPENDIMO MADURO) DE LOS RATONES WILD TYPE, LAS CELULAS DE LA ZONA ENTRICULAR ESTAN UNIDAS MEDIANTE EXTENSAS UNIONES TIPO ZONULA ADHERENTE DEPENDIENTES DE N-CADHERINA. POR EL CONTRARIO, AL ANALIZAR LOS RATONES HYH EN REGIONES ESPECIFICAS, PREVIO A QUE OCURRA LA DESORGANIZACION Y DENUDAMIENTO DEL NEUROEPITELIO/EPENDIMO, SE OBSERVO UNA DRASTICA REDUCCION EN EL NUMERO DE UNIONES ADHERENTES, PRESENCIA DE UNIONES ULTRAESTRUCTURALMENTE ANOMALAS, Y UNA DISTRIBUCION SUBCELUAR ANORMAL DE N-CADHERINA, PRESENTANDO UN PATRON INMUNORREACTIVO CITOPLASMATICO Y GRANULAR EN LUGAR DEL PATRON MEMBRANOSO Y LINEAL DE LOS ANIMALES WILD TYPE. ESTOS RESULTADOS SUGIEREN FUERTEMENTE, QUE LA DISFUNCION DE ALFA-SNAP PROVOCA UNA ALTERACION EN EL TRAFICO DE N-CADHERINA HACIA LA MEMBRANA PLASMATICA EN LAS CELULAS DEL NEUROEPITELIO/EPENDIMO. APOYANDO ESTA IDEA, EL ANALISIS MEDIANTE WESTERN BLOT EN DIFERENTES REGIONES DEL SNC Y A DIFERENTES EDADES, PERMITIERON DETERMINAR QUE LOS NIVELES DE N-CADHERINA SE ENCUENTRAN AUMENTADOS EN LOS RATONES HYH. ESTUDIOS NEUROPATOLOGICOS DETALLADOS DE LAS PAREDES VENTRICULARES EN ESTADIOS POSTNATALES PERMITIERON DETERMINAR LA PRESENCIA DE ROSETAS SUBVENTRICULARES EN REGIONES ESPECIFICAS DEL SISTEMA VENTRICULAR DE LOS RATONES MUTANTES. LA FORMACION DE ROSETAS SUBVENTRICULARES ES UN FENOMENO NEUROPATOLOGICO ASOCIADO A DEFECTOS EN LAS UNIONES ADHERENTES DEL NEUROEPITELIO/EPENDIMO. ESTE HALLAZGO TAMBIEN SE OBSERVO EN MUESTRAS SE FETOS HUMANOS CON HIDROCEFALIA CONGENITA Y MIELOMENINGOCELE. LA DISFUNCION DE LAS UNIONES ADHERENTES EN LAS CELULAS TRONCALES DE LOS RATONES HYH SE CONFIRMO MEDIANTE ESTUDIOS EX VIVO EN NEUROESFERAS. LAS NEUROESFERAS OBTENIDAS A PARTIR DE RATONES HYH SON MAS PEQUEÑAS QUE LAS OBTENIDAS A PARTIR DE RATONES WILD TYPEL ESTUDIOS DE PROLIFERACION CELULAR, APOPTOSIS Y ADHESION CELULAR SUGIEREN QUE EL MENOR TAMAÑO SE DEBE FUNDAMENTALMENTE A UNA MENOR CAPACIDAD AGREGATIVA DE SUS CELULAS. ENSAYOS DE AGREGACION CELULAR Y DEGREGACION CELULAR EN NEUROESFERAS WILD TYPE Y MUTANTES HYH SOMETIDAS A TRATAMIENTOS CON QUELANTE DE CALCIO O CON PEPTIDO COMPETIDOS DE N-CADHERINA, MOSTRARON QUE LAS UNIONES ADHERENTES DE LAS CELULAS HYH SON MAS LABILES Y POR LO TANTO MAS SENSIBLES A LOS TRATAMIENTOS UTILIZADOS. COMPLEMENTANDO ESTOS HALLAZGOS, SE REALIZARON ENSAYOS DE BLOQUEO FUNCIONAL DE N-CADHERINA EN EXPLANES DE EPENDIMO MULTICILIADO MADURO. EL BLOQUEO DE LAS UNIONES ADHERENTES CON PEPTIDO COMPETIDOR DE N-CADHERINA PROVOCO (I) UNA DISTRIBUCION SUBCELULAR ANOMALA DE N-CADHERINA, (II) ALTERACIONES ULTRAESTRUCTURALES EN LAS UNIONES ADHERENTES Y AUMENTO DE LOS ESPACIOS INTERCELULARES, (IV) AUMENTO EN LOS INDICES DE APOPTOSIS, Y (V) DENUDAMIENTO EPENDIMARIO. ESTOS ENSAYOS DEMUESTRAN LA IMPORTANCIA FUNCIONAL DE LAS UNIONES ADHERENTES DEPENDIENTES DE N-CADHERINA EN LA ESTABILIDAD ESTRUCTURAL DE EPENDIMO. FINALMENTE, SE ESTUDIARON ALGUNAS DE LAS CONSECUENCIAS DE LA PERDIDA DEL NEUROEPITELIO/EPENDIMO. TRABAJOS PREVIOS REALIZADOS EN NUESTRO INSTITUTO HABIAN DEMOSTRADO COMO LA AUSENCIA DEL EPENDIMO GATILLA LAñoBLITERACION ACUEDUCTA Y EL DESARROLLO DE HIDROCEFALIA. EN EL PRESENTE TRABAJO SE DETERMINO, MEDIANTE MARCAJE CON BRDU EN PULSO Y ACUMULATIVO EN ANIMALES POSTNATALES, QUE LA PERDIDA DEL NEUROEPITELIO/EPENDIMO SE ASOCIA A UNA REDUCCION DE LA CAPACIDAD PROLIFERATIVA EN LA ZONA SUBVENTRICULAR DE LOS VENTRICULOS LATERALES LO CUAL RESULTARIA EN UNA DEFICIENCIA EN LOS PROCESOS NEUROGENICOS POSTNATALES. ADEMAS, SE DETERMINO LA PRESENCIA DE HETEROTOPIAS PERIVENTRICULARES INTIMAMENTE ASOCIADAS A LAS PAREDES DENUDADAS. AMBOS TRASTORNOS RESULTARIAN DE LA PERDIDA DEL NEUROEPITELIO/EPENDIMO, ASOCIANDO A NIVEL ETIOPATOGENICO EL DESARROLLO DE HIDROCEFALIA CON TRASTORNOS EN EL DESARROLLO CORTICAL. LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN LA PRESENTE TESIS APOYAN UNA NUEVA CONCEPCION DE LA HIDROCEFALIA, Y DESTACA EL ROL CLAVE QUE DESEMPEÑA EL NEUROEPITELIO/EPENDIMO EN LA GENESIS DE ESTA PATOLOGIA. ALTERACIONES DE LA MAQUINARIA GENERAL DE FUSION DE MEMBRANAS, PARTICULARMENTE EN LOS MECANISMOS INVOLUCRADOS EN LA FORMACION DE UNIONES ADHERENTES EN LA ZONA VENTRICULAR DURANTE EL DESARROLLO EMBRIONARIO Y POSTNATAL TEMPRANO. PARECEN CONSTITUIR UNA VIA PATOGENICA COMUN DE DIFERENTES PATOLOGIAS QUE RESULTAN EN HIDROCEFALIA Y TRASTORNOS DEL DESARROLLO CEREBRAL. LA INSEPARABLE ASOCIACION, A NIVEL ETIOLOGICO, ENTRE LAS ALTERACIONES DEL NEUROEPITELIO/EPENDIMO, EL PROCESO HIDROCEFALICO Y EL MAL DESARROLLO CORTICAL INDICA QUE SE DEBEN DESARROLLAR NUEVAS ESTRATEGIAS PARA EL DIAGNOSTICO Y TRATAMIENTO DE ESTAS PATOLOGIAS. |