| LA INTEGRASA (IN) ES UNA PROTEINA VIRAL ESENCIAL PARA EL CICLO REPLICATIVO DEL VIRUS DE LA LEUCEMIA MURNA DE MOLONEY (M-MULV) QUE CATALIZA EL PROCESAMIENTO 3' Y LA INTEGRACION DEL DNA VIRAL EN EL GENOMA DE LA CELULA HUESPED. ESTA ENZIMA CONTIENE TRES DOMINIOS; EL DOMINIO N-TERMINAL, EL DOMINIO CENTRAL Y EL C-TERMINAL. EL DOMINIO CENTRAL POSEE LA ACTIVIDAD CATALITICA Y EN SU ESTRUCTURA PRESENTA UNA REGION QUE FORMA UN ASA. ESTA REGION POSEE HOMOLOGIA DE SECUENCIA ENTRE LAS INTEGRASAS DE DISTINTOS RETROVIRUS Y SE DESCONOCE SI ES IMPORTANTE EN LA ACTIVIDAD CATALITICA. SIN EMBARGO, EN LA IN DE HIV ESTA REGION PRESENTA UN ALTO GRADO DE FLEXIBILIDAD, ADEMAS EXISTEN EVIDENCIAS EN QUE RESIDUOS ESPECIFICOS DEL ASA INTERACTUAN CON LOS EXTREMOS DEL LTR (LONG TERMINAL REPEAT) PROCESADO Y SE HA SUGERIDO QUE EL ASA FLEXIBLE DE LA IN DE HIV ESTABILIZA EL COMPLEJO DE INTEGRACION Y POSICIONA EL 3'OH DURANTE LA TRANSFERENCIA DE HEBRA. POR HOMOLOGIA DE SECUENCIAS ENTRE LAS INS SE ESTABLECIO QUE EL ASA DE LA IN DE M-MULV CORRESPONDE A LOS AMINOACIDOS 208 A 218. SE SELECCIONARON LOS RESIDUOS H208, Y211, R212, Q214, S215, S216 Y Q218 DEL ASA DE LA IN DE M-MULV PARA HACER MUTAGENESIS SITIO DIRIGIDA. ESTOS RESIDUOS SE SELECCIONARON POR SU CONSERVACION ENTRE LAS INS Y/O PORQUE SUS CADENAS LATERALES POSEEN GRUPOS FUNCIONALES CAPACES DE INTERACCIONAR CON DNA. SE DETERMINO SU FUNCION EN LA ACTIVIDAD CATALITICA IN VITRO E IN VIVO. LOS RESULTADOS IN VITRO MUESTRAN QUE H208 ES ESENCIAL EN LA ACTIVIDAD CATALITICA DE LA IN, YA QUE LA MUTACION H208A SUPRIMIO TODAS LAS ACTIVIDADES CATALITICAS DE LA IN. POR OTRO LADO, LA HIDROFOBICIDAD DE LA Y211 ES FUNDAMENTAL EN LA REGION YA QUE LA MUTACION Y211A DISMINUYO LA INTEGRACION CONCERTADA, TRANSFERENCIA DE HEBRA Y DESINTEGRACION, MIENTRAS QUE LAS MUTACIONES Y211F E Y211W SON ACTIVAS. A EXCEPCION DE LA MUTACION Q214N, TODAS LAS MUTACIONES DE R212 Y Q214 DISMINUYEN LA INTEGRACION CONCERTADA Y TRANSFERENCIA DE HEBRA, ADEMAS DE LAS MUTACIONES R212Q Y Q214A DISMINUYERON EL FOTO-ENTRECRUZAMIENTO, SUGIRIENDO UN CAMBIO ESTRUCTURAL QUE IMPIDE UN CORRECTO POSICIONAMIENTO DEL SUSTRATO. MUTACIONES EN S215 Y S216 NO TIENEN NINGUN EFECTO EN LA ACTIVIDAD Y A EXCEPCION DE LA MUTACION H208A, TODAS LAS MUTACIONES SON ACTIVAS EN EL PROCESAMIENTO 3'. CUANDO ANALIZAMOS EL EFECTO DE LAS MUTACIONES EN LA REPLICACION VIRAL, OBSERVAMOS QUE LOS VIRUS MUTANTES Y211A, R212A, Q214A, Q214N Y Q218A SUPRIMIERON LA REPLICACION DEL VIRUS, MIENTRAS QUE LAS S215A Y S216A PRESENTARON UN PERFIL DE REPLICACION SIMILAR AL OBSERVADO CON EL VIRUS SILVESTRE. EL DOMINIO CATALITICO DE LA IN DE M-MULV SE MODELO; SEGUN NUESTRO MODELO EL ASA SE ENCUENTRA ENTRE L207 Y S216. SE ANALIZO LA FLEXIBILIDAD DE LA REGION 207 A 216 EN LA IN SILVESTRE Y LAS MUTACIONES. ENCONTRAMOS QUE LAS MUTACIONES H208A, Y211A, R212A Y R212K, QUE POSEEN UNA BAJA ACTIVIDAD CATALITICA, PRESENTARON UNA BAJA FLEXIBILIDAD. POR EL CONTRARIO, LAS MUTACIONES ACTIVAS Y211W. Q214N, S215A Y S216A, TIENEN UNA FLEXIBILIDAD SIMILAR O MAYOR QUE EL ASA SILVESTRE. NUESTROS RESULTADOS DEMUESTRAN QUE LA IN DE M-MULV PRESENTA UN ASA FLEXIBLE CERCANA AL SITIO CATALITICO Y LOS RESIDUOS H208, Y211, R212 Y Q214 ESTAN INVOLUCRADOS EN EL CORRECTO ENSAMBLE DEL COMPLEJO IN-ACIDO NUCLEICO NECESARIO EN EL PROCESO DE INTEGRACION. |