| EL ESTABLECIMIENTO DEL PATRON DORSO-VENTRAL HA SIDO AMPLIAMENTE ESTUDIADO EN XENOPUS, UNO DE LOS MODELOS MAS UTILIZADOS PARA ENTENDER EL DESARROLLO EMBRIONARIO DE LOS VERTEBRADOS. DESDE EL DESCUBRIMIENTO DEL ORGANIZADOR DE SPEMANN, REGION DEL EMBRION CAPAZ DE GENERAR UN EJE DORSAL SECUNDARIO CUANDO SE TRANSPLANTA EN LA REGION VENTRAL, MUCHAS BUSQUEDAS DE GENES SE HAN REALIZADO Y HOY SE CONOCEN VARIOS GENES INVOLUCRADOS EN EL ESTABLECIMIENTO DEL PATRON DORSO-VENTRAL. ESTAS BUSQUEDAS FUERON REALIZADAS ANTES DE DISPONER DE LA SECUENCIA GENOMICA Y, SI BIEN HAN SIDO EXITOSAS, NO HAN SIDO EXHAUSTIVAS Y HAN ESTADO SESGADAS A LA DETECCION DE LOS TRANSCRITOS MAS ABUNDANTES, LOS MAS ACTIVOS O LOS DEPENDIENTES DE LA VIA WNT/BETA-CATENINA. LA EVIDENCIA RECIENTE DERIVADA DE LAS APROXIMACIONES GLOBALES DE EXPRESION GENICA INDICA QUE LOS TRANSCRIPTOMAS SON MUCHO MAS COMPLEJOS DE LO QUE SE PENSABA ANTERIORMENTE Y DEMUESTRA QUE LOS ESTUDIOS GLOBALES DE EXPRESON GENICA SON HERRAMIENTAS VALIOSAS PARA IDENTIFICAR NUEVOS GENES. EN ESTA TESIS SE UTILIZO LA METODOLOGIA SAGE (SERIAL ANALYSIS OF GENE EXPRESSION) CON EL OBJETIVO DE IDENTIFICAR NUEVOS GENES INVOLUCRADOS EN EL ESTABLECIMIENTO DEL PATRON DORSOVENTRAL, REALIZANDO UNA COMPARACION DEL TRANSCRIPTOMA DORSAL Y VENTRAL EN EL ESTADIO DE GASTRULA DE X. TROPICALIS. LA ASINGACION DE LOS 23,766 TAGS EXPERIMENTALES OBTENIDOS MEDIANTE SAGE FUE REALIZADA UTILIZANDO LA SECUENCIA GENOMICA Y LAS BASES DE DATOS DE TRANSCRITOS DE X. TROPICALIS, DE ACUERDO A UN PROTOCOLO MODIFICADO DE ASIGNACION GENICA JERARQUICA (HGA). DE LOS 23,455 TAGS EXPERIMENTALES ENCONTRADOS EN EL GENOMA, SOLO EL 54.5 POR CIENTO PUDO SER ASIGNADO A TRANSCRITOS EN FORMA CONFIABLE. EL RESTANTE 45.5 POR CIENTO DE LOS TAGS EXPERIMENTALES PROBABLEMENTE DERIVA DE TRANSCRITOS NUEVOS, INDICANDO QUE LA ANOTACION ACTUAL DEL GENOMA DE X. TROPICALIS SE ENCUENTRA AUN INCOMPLETA. LOS TAGS ESPERADOS DE GENES CON DIFERENCIA DE EXPRESION DESCRITA EN EL EJE DORSOVENTRAL EN LAS GENOTECAS DORSAL Y VENTRAL PRESENTARON LA DISTRIBUCION ESPERADA, INDICANDO QUE LAS GENOTECAS FUERON PREPARADAS CORRECTAMENTE. PARA IDENTIFICAR NUEVOS TRANSCRITOS CON DIFERENCIA DE EXPRESION EN EL EJE DORSO-VENTRAL, SE GENERO UN CONJUNTO DE 125 TAGAS EXPERIMENTALES CON DIFERENCIA SIGNIFICATIVA DE FRECUENCIA DE OCURRENCIA ENTRE AMBAS GENOTECAS. DE ESTOS 125 TAGS, 21 TAGS FUERON SELECCIONADOS PARA VERIFICAR EXPERIMENTALMENTE LA DIFERENCIA DE EXPRESION EN EL EJE DORSO-VENTRAL. ADEMAS DE LA ASIGNACION IN SILICO, SE UTILIZO LA APROXIMACION EXPERIMENTAL SAGE REVERSO, QUE PERMITE ALARGAR EXPERIMENTALMENTE LA SECUENCIA DE UN TAG DE INTERES PARA ASIGNAR EL TAG A UNA POSICION GENOMICA EN PARTICULAR. DEL CONJUNTO DE 21 TAGS, 20 TAGS PUDIERON SER ASIGNADOS EN FORMA CONFIABLE, MEDIANTE BIOINFORMATICAño SABE REVERSO. CINCO DE LOS 20 TAGS FUERON ASIGNADOS A GENES CON DIFERENCIA DE EXPRESION CONOCIDA EN EL EJE DORSO-VENTRAL. LOS RESTANTES 15 TAGAS FUERON ASIGNADOS A TRANSCRITOS NUEVOS SIN DIFERENCIA DE EXPRESION DESCRITA PREVIAMENTE. LA DIFERENCIA DE EXPRESION EN EL EJE DORSO-VENTRAL FUE ESTUDIADA PARA 13 DE ESTOS 15 TRANSCRITOS EN X. TROPICALIS Y PARA LOS HOMOLOGOS IDENTIFICADOS EN X. LAEVIS. EL ANALISIS MEDIANTE RT-PCR Y/O HIBRIDACION IN SITU CONFIRMO LA DIFERENCIA PARA 9 DE LOS 13 TRANSCRITOS EN X. TROPICALIS Y PARA LOS 7 TRANSCRITOS IDENTIFICADOS EN X. LAEVIS. PARA DOS TRANSCRITOS NUEVOS DE EXPRESION DORSAL, DV12 Y DV18, SE REALIZARON ESTUDIOS DE PERDIDA DE FUNCION ENX. LAEVIS UTILIZANDO MORFOLINOS, OLIGOMEROS ANTI-SENTIDO DISEÑADOS ESPECIFICAMENTE PARA BLOQUEAR LA TRADUCCION DE TRANSCRITOS. DV12 Y DV18 SON TRANSCRITOS ALTAMENTE CONSERVADOS EN ANIMALES Y NO SE HA DESCRITO LA FUNCION DE NINGUNO DE ELLOS. ESTOS ESTUDIOS INDICARON QUE AMBOS TRANSCRITOS SON NECESARIOS PARA LA DIFERENCIACION NEURONAL DEBIDO A QUE LA INYECCION DE MORFOLINOS PRODUCE LA PERDIDA DE MARCADORES NEURONALES COMO N-TUBULINA, ENGRAILED-2 Y KROX-20. LOS ENSAYOS DE GANANCIA DE FUNCION DE DV12 Y DV18 MOSTRARON QUE AMBOS TRANSCRITOS INDUCEN LA EXPRESON EXTOPICA DE N.TUBULINA, RESULTADOS CONSISTENTES CON SU PROBABLE FUNCION EN NEUROGENESIS. OTRO TRANSCRITO ESTUDIADO EN PROFUNDIDAD CORRESPONDE A DV05, DERIVADO DE UN ELEMENTO TRANSPONIBLE DE LA SUPERFAMILIA DE TTRANSPOSONES DE DNA TC1, PARA EL CUAL NO SE HA ENCONTRADO HOMOLOGO EN X. LAEVIS. DE FORMA INTERESANTE, SE OBSERVO QUE AMBAS HEBRAS (SENTIDO Y ANTI-SENTIDO) DE ESTE TRANSCRITO SE EXPRESAN ASIMETRICAMENTE EN EL EJE DORSO-VENTRAL. ESTE GEN TIENE 116 OCURRENCIAS EN EL GENOMA DE X. TROPICALIS Y LA MAYORIA DE ELLOS CORRESPONDE A COPIAS INACTIVAS POR MUTACIONES. EL ANALISIS DE CLONES DE CDNA DE DV05 MOSTRO QUE NINGUNO DE LOS CLONES CODIFICARIA UNA TRANSPOSASA FUNCIONAL. SE HA PROPUESTO QUE TRANSCRITOS DERIVADOS DE ELEMENTOS TRANSPONIBLES GENERAL SIRNAS QUE PARTICIPARIAN EN EL SILENCIAMIENTO DE TRANSPOSONES Y/O REGULACION DE LA CROMATINA. FUTUROS ENSAYOS FUNCIONALES SON NECESARIOS PARA DETERMINAR SU PARTICIPACION EN EL DESARROLLO EMBRIONARIO. EN CONCLUSION, ESTA TESIS GENERO UNA LISTA DE TRANSCRITOS CON DIFERENCIA DE EXPRESION NO DESCRITA EN EL EJE DORSO-VENTRAL DE XENOPUS. LOS ESTUDIOS FUNCIONALES PARA DOS DE ELLOS SON CONSISTENTES CON LA DIFERENCIA DE EXPRESION DETECTADA MEDIANTE SAGE Y SUGIEREN QUE LA LISTA DE TRANSCRITOS OBTENIDA INCLUYE NUEVOS GENES INVOLUCRADOS EN EL ESTABLECIMIENTO DEL PATRON DORSO-VENTRAL DE LOS VERTEBRADOS. |