| EL FACTOR TRANSFORMANTE TIPO BETA (TGF-BETA), ES UNA CITOQUINA QUE REGULA MUCHOS PROCESOS CELULARES. SU ACCION BIOLOGICA SE LLEVA A CABO A TRAVES DE LA UNION A SUS RECEPTORES DE TIPO I Y TIPO II (RIBETA Y RIIBETA) QUE TIENEN ACTIVIDAD SERINA/TREONINA QUINASA EN SUS DOMINIOS CITOPLASMATICOS. EN LAS CELULAS MUSCULARES ESQUELETICA, TGF-BETA ES UN INHIBIDOR DE LA MIOGENESIS, AFECTANDO LOS NIVELES DE MIOSINA Y CREATINA QUINASA IN VITRO. RESULTADOS EN NUESTRO LABORATORIO NOS INDICAN QUE LOS NIVELES DE LOS RECEPTORES DE TGF-BETA AUMENTAN DURANTE LA DIFERENCIACION, PERO QUE SUS MOLECULAS TRANSDUCTORAS CANONICAS DISMINUYEN. MIOBLASTOS QUE EXPRESAN UN DOMINANTE NEGATIVO DEL RIIBETA, NO SON CAPACES DE DIFERENCIARSE, LO CUAL SUGIERE QUE ESTOS RECEPTORES PUEDEN TENER UN ROL DURANTE EL PROCESO DE DIFERENCIACION. POR LO TANTO NOS INTERESO ESTUDIAR EL REQUERIMIENTO DE LOS RECEPTORES DE TGF-BETA PARA LA DIFERENCIACION, Y PARA ELLO INHIBIMOS SUS ACTIVIDADES SERINA/TREONINA QUINASA. DETERMINAMOS QUE DURANTE LA MIOGENESIS HAY UN AUMENTO DE LA FOSFORILACION DE LOS RECEPTORES DE TGF-BETA EN LOS RESIDUOS SERINA Y TREONINA, LO CUAL NOS SUGIERE QUE ESTOS TENDRIAN ACTIVIDAD QUINASA. LOS MARCADORES TARDIOS DE LA DIFERENCIACION (NIVELES MIOSINA, ACTIVIDAD CREATINA QUINASA Y FUSION DE LOS MIOTUBOS). SE VEN DISMINUIDOS AL INHIBIR LA ACTIVIDAD QUINASA DE LOS RECEPTORES DE TGF-BETA MEDIANTE UN DOMINANTE NEGATIVO DEL RIIBETAño UN INHIBIDOR DE LA ACTIVIDAD QUINASA DEL RIBETA. SIN EMBARGO, LOS MARCADORES TEMPRANOS DE LA DIFERENCIACION SE VEN FAVORECIDOS AL INHIBIR LA ACTIVIDAD QUINASA DE LOS RECEPTORES DE TGF-BETA (AUMENTO INDUCCION REPORTERO DE MIOGENINA AL IGUAL QUE LA PROTEINA, NO OBSERVAMOS DIFERENCIAS EN LA TRASLOCACION NUCLEAR DE MIOGENINA). LO ANTERIOR NOS SUGIERE QUE LOS RECEPTORES DE TGF-BETA INHIBIEN EL PROCESO TEMPRANO DE LA DIFERENCIACION, PERO QUE SE REQUIEREN PARA EVENTOS POSTERIORES DE LA DIFERENCIACION MUSCULAR ESQUELETICA. TGF-BETA ACTIVA A LAS PROTEINAS SMADS (VIA CANONICA), PERO TIENE LA CAPACIDAD DE ACTIVAR OTRAS VIAS (VIAS NO CANONICAS), INCLUYENDO LA VIA DE LA FAMILIA DE LAS MAPK (ERK, C-JUN Y P38) Y LA VIA PI3K. ADEMAS, TANTO LA VIA DE P38 Y PI3K SON IMPORTANTES EN LA DIFERENCIACION MUSCULAR, POR LO TANTO, LOS RECEPTORES DE TGF-BETA PODRIAN ESTAR ACTIVANDO LAS VIAS DE SEÑALIZACION NO CANONICA Y DE ESTA MANERA FACILITANDO EL PROCESO DE LA MIOGENESIS. EN BASE A LO ANTERIOR ESTUDIAMOS CUAL ES LA VIA DE SEÑALIZACION QUE INDUCEN LOS RECEPTORES DE TGF-BETA DURANTE LA MIOGENESIS. ESTABLECIMOS QUE AL SOBRE EXPRESAR SMAD-7, SMAD INHIBITORIA, LA FUSION DE LOS MIOBLASTOS NO SE VE ALTERADA (INCLUSO SE OBSERVA UN LEVE AUMENTO) Y QUE EN PRESENCIA DEL SIRNA CONTRA SMAD-2/3, TANTO MARCADORES TEMPRANOS (MIOGENINA) COMO TARDIOS (CREATINA QUINASA, FUSION Y MIOSINA) ESTAN AUMENTADOS. ESTO NOS SUGIERE QUE LA VIA QUE ACTIVAN LOS RECEPTORES DURANTE LA DIFERENCIACION ES SMAD INDEPENDIENTE. DETERMINAMOS QUE LOS RECEPTORES DE TGF-BETA PODRIAN ESTAR ACTIVANDO LA VIA DE AKT DURANTE LA DIFERENCIACION YA QUE LA FOSFORILACION DE AKT ESTA DISMINUIDA EN MIOBLASTADOS INDUCIDOS A DIFERENCIAR CON LA ACTIVIDAD QUINASA DEL RIBETA INHIBIDA. ADEMAS, AL AGREGAR IGF (ACTIVADOR DE LA VIA KT), HAY UNA REVERSION PARCIAL EN LA FUSION DE MIOBLASTOS, AL SER INDUCIDOS A DIFERENCIAR EN PRESENCIA DEL INHIBIDOR DEL RIBETA. POR OTRA PARTE TGF-BETA TIENEN LA CAPACIDAD DE INDUCIR LA EXPRESION DE INTEGRINAS. SABIENDO QUE ESTAS MOLECULAS TIENEN IMPORTANCIA EN EL PROCESO DE FUSION, EN ESTA TESIS, ADEMAS, NOS INTERESO EVALUAR SI LOS RECEPTORES DE TGF-BETA REGULAN MOLECULAS IMPORTANTES EN EL PROCESO DE FUSION DE MIOTUBOS, COMO SON INTEGRINAS BETA1, N Y M-CADERINAS. POR LO TANTO ESTUDIAMOS LA IMPORTANCIA DE LOS RECEPTORES DE TGF-BETA EN LA FUSION DE LOS MIOBLASTOS, ANALIZANDO MOLECULAS FUNDAMENTALES PARA DICHO EVENTO. MIOBLASTOS CON LA ACTIVIDAD QUINASA DEL RECEPTOR I DE TGF-BETA INHIBIDA TIENEN UNA MENOR INCORPORACION A MIOTUBOS PREFORMADOS EN COMPARACION A MIOBLASTOS CONTROLES. DETERMINAMOS QUE AL INHIBIR EL RIBETA, DE LAS MOLECULAS QUE PARTICIPAN EN LA FUSION, LOS NIVELES PROTEICOS DE INTEGRINA BETA1 Y N-CADERINA ESTAN DISMINUIDOS. NO OBSERVAMOS DIFERENCIAS EN LOS NIVELES DE M-CADERINA Y TAMPOCO EN LOS NIVELES DE FOSFORILACION DE FAK. TGF-BETA SE HA DESCRITO COMO UN INHIBIDOR DE LA DIFERENCIACION, SIN EMBARGO SE HA DETECTADO EN LA MIOGENESIS Y VARIOS ESTUDIOS INDICAN QUE EN DETERMINADAS CONDICIONES TIENE EFECTOS PROMIOGENICOS, POR LO QUE EVALUAMOS SI ERA NECESARIO UN LIGANDO PARA QUE LOS RECEPTORES DE TGF-BETA EJERCIERAN SU EFECTO EN LA DIFERENCIACION MUSCULAR. POR LO TANTO, PARA SECUESTRAR EL POSIBLE LIGANDO UTILIZAMOS EL RIIBETA SOLUBLE, Y OBSERVAMOS UNA DISMINUCION EN LA ACTIVIDAD CREATINA QUINASA. EN PRESENCIA DE UN ANTICUERPO BLOQUEADOR DE TGF-BETA1 Y 3, Y BETAGLICAN (SECUESTRADOR DE TGF-BETA2), NO DETECTAMOS ALTERACIONES EN LOS NIVELES DE ACTIVIDAD CREATINA QUINASA CON RESPECTO A LOS CONTROLES. LO ANTERIOR NO SUGIERE QUE SE REQUIERE UN LIGANDO AUTOCRINO PARA ACTIVAR A LOS RECEPTORES DE TGF-BETA, PERO QUE APARENTEMENTE NO SERIA NINGUNA ISOFORMA DE TGF-BETA. |