| SHIGELLA FLEXNERI ES UN PATOGENO INTRACELULAR CAUSANTE DE SHIGELOSIS EN EL HOMBRE. LA INFECCION SE BASA EN LA HABILIDAD DE LOS ORGANISMOS DE PENETRAR LA CELULA HOSPEDERA A NIVEL DEL COLON, MULTIPLICARSE EN SU INTERIOR Y DISEMINARSE INTERCELULARMENTE. SHIGELLA INGRESA POR LA PORCION BASOLATERAL DE LA CELULA EPITELIAL, Y LA INVASION ES MEDIADA POR EL ENSAMBLAJE Y SECRECION DE PROTEINAS A TRAVES DE UN SISTEMA DE SECRECION TIPO TRES (SSTT) CODIFICADO EN EL PLASMIDO DE INVASION. LAS PROTEINAS QUE MEDIAN LA INVASION Y DISEMINACION DE SHIGELLA EN EL EPITELIO HAN SIDO EXTENSAMENTE ESTUDIADAS. EN CONTRASTE, EL LIPOPOLISACARIDO (LPS), PRINCIPAL COMPONENTE DE LA MEMBRANA EXTERNA DE BACTERIAS GRAM NEGATIVO, HA RECIBIDO MENOR ATENCION. ASI, EL PAPEL DE ESTA MOLECULA EN EL PROCESO INVASIVO NO SE HA ESCLARECIDO. EL LPS ESTA CONSTITUIDO POR TRES DOMINIOS ESTRUCTURALES: EL LIPIDO ANCLADO EN LA MEMBRANA EXTERNA, EL OLIGOSACARIDO CORE Y EL ANTIGENO O (AGO), UN POLISACARIDO PROYECTADO DESDE LA SUPERFICIE BACTERIANA HACIA EL EXTERIOR. S. FLEXNERI 2A PRESENTA DOS LARGOS DE CADENA DE AGO CARACTERISTICOS, UNO CORTO DE 11 A 17 UNIDADES REPETIDAS (S-AGO) Y UNO LARGO DE MAS DE 90 UNIDADES REPETIDAS (VL-AGO). ESTOS LARGOS DE CADENA PREFERENCIALES ESTAN MODULADOS POR LOS REGULADORES WZZB Y WZZPHS2, RESPECTIVAMENTE. POR OTRA PARTE, EXISTE ESCASA INFORMACION REPSECTO A LOS MECANISMOS INVOLUCRADOS EN LA REGULACION DE LA PRODUCCION DEL LPS DE SHIGELLA. A DIFERENCIA DE LA ABUNDANTE INFORMACION QUE EXISTE RESPECTO A QUE SEÑALES AMBIENTALES REGULAN LA EXPRESON DE PROTEINAS DEL SSTT DE SHIGELLA, SE CONOCE RELATIVAMENTE POCO SOBRE LA REGULACION AMBIENTAL DE LA SINTESIS DEL LPS Y DE LA RELACION DE ESTE CON LA INVASION DEL EPITELIO. EL OBJETIVO DE ESTA TESIS FUE DEFINIR, POR UNA PARTE, SI EL LPS PARTICIPA PARTICULARMENTE EN LA ENTRADA DE LA BACTERIA A LA CELULA EPITELIAL Y POR OTRA, SI LAS CONDICIOES QUE ENFRENTA LA BACTERIA EN EL INTESTINO MODULAN LA PRODUCCION DE LPS PARA FAVORECER LA INVASION LOS RESULTADOS MOSTRARON QUE EL AGO DEL LPS PARTICIPA EN LA ENTRADA DE LA BACTERIA A LA CELULA POR LA PORCION BASOLATERAL DE CELULAS CACO-2 POLARIZADAS. MUTANTES EN WZZB, COMO EN WZZPHS2 FUERON HIPOINVASIVAS, AUNQUE MOSTRARON NIVELES DE ADHERENCIA NORMALES. LA PARTICIPACION DE AGO POLIMERICO EN ESTA ETAPA NO SERIA UN LIGANDO PARA RECEPTORES ESPECIFICOS EN LA MEMBRANA BASOLATERAL DE LA CELULA COLONICA, PUES LOS LPS EXTRAIDOS DE S. FLEXNERI SILVESTRE Y DE LAS MUTANTES WZZPHS2 Y WZZB NO INHIBIERON LA ENTRADA DE S. FLEXNERI A LA CELULA EPITELIAL. PARA DEFINIR SI ESTAS OBSERVACIONES SON EXCLUSIVAS DE UN MODELO DE CELULAS DIFERENCIADAS, SE REALIZARON ENSAYOS DE INVASION Y ADHERENCIA EN EL MODELO MAS AMPLIAMENTE UTILIZADO PARA EL ESTUDIO DE LA INVASION POR SHIGELLA, CELULAS HELA, Y EN CELULAS CACO-2 QUE NO FUERON SOMETIDAS AL PROCEDIMIENTO DE DIFERENCIACION. OBSERVAMOS QUE EXISTEN DIFERENCIAS IMPORTANTES EN LOS REQUERIMIENTOS DE LPS PARA LA INVASION EN CELULAS NO POLARIZADAS RESPECTO A LAS POLARIZADAS Y TAMBIEN, IMPORTANTES DIFERENCIAS ENTRE LOS DOS MODELOS DE CELULAS NO POLARIZADAS. MIENTRAS EN CELULAS HELA LA PRESENCIA DEL AGO ES NECESARIO PARA LA INVASION, EN CACO-2 SE OBSERVO UNA INVASION NORMAL EN MUTANTES CARENTES DE AGO (WAAL WAAAD). EN NIGUNA DE LAS CELULAS NO DIFERENCIADAS HUBO UN REQUERIMIENTO ESPECIFICO POR UN LARGO DE CADENA EN PARTICULAR. TAMPOCO SE OBSERVO DEFECTOS EN LA ADHERENCIA EN NINGUNA DE LAS MUTANTES EN EL LPAS, IGUAL QUE EN CELULAS POLARIZADAS. ESTOS RESULTADOS DEMOSTRARON QUE LA UTILIZACION DE UN MODELO IN VITRO QUE IMITE DE MANERA MAS CERCANA AL PROCESO DE INVASION INVIVO, PERMITE OBSERVAR DIFERENCIAS IMPORTANTES CON LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN LAS LINEAS CELULARES CORRIENTEMENTE USADAS, QUE PUEDEN EXPLICAR LOS DATOS CONTRADICTORIOS DE LA LITERATURA RESPECTO AL PAPEL DEL LPS EN LA INVASION POR SHIGELLA. SE EVALUO SI CONDICIONES AMBIENTALES PREVALENTES EN EL INTESTINO MODULAN LA PRODUCCION DE LPS, DE MANERA QUE PRESENTE LAS CARACTERISTICAS NECESARIAS PARA LA INVASION. PARA ELLO, SE ESTUDIO EL EFECTO DE LA ALTAñoSMOLARIDAD Y MICROAEROFILIA SOBRE LA PRODUCCION DE LPS Y SOBRE LA ACTIVIDAD DE GENES INVOLUCRADOS EN LA BIOSINTESIS DEL AGO. NO SE OBSERVO CAMBIOS EN EL PATRON DE LPS EN GELES DE POLIACRILAMIDA SDS-TRICINA EN NINGUNA DE LAS CONDICIONES DE CULTIVO; SIN EMBARGO LA BAJA TENSION DE O2 AUMENTO SIGNIFICATIVAMENTE LA ACTIVIDAD TRANSCRIPCIONAL DE LOS GENES WZZPHS2 Y WZZB. LA ALTAñoSMOLARIDAD, EN CAMBIO NO GENERO NINGUN CAMBIO EN LA EXPRESION GENICA. NINGUNA DE LAS DOS CONDICIONES MODIFICO LA ACTIVIDAD DEL OPERON WBA, RESPONSABLE DE LA BIOSINTESIS DEL AGO. ADEMAS SE EVALUO SI LA INTERACCION DE LA BACTERIA CON LA CELULA EPITELIAL AFECTABA LA PRODUCCION DE LPS. LOS RESULTADOS MOSTRARON QUE S. FLEXNERI RECUPERADA DEL MDEIO INTRACELULAR PRODUJO S-AGO Y NO VL-AGO. EN CONTRASTE, LAS BACTERIAS EXTRACELULARES PRODUJERON UN LPS COMPLETO COMPUESTO POR S Y VL-AGO. LOS RESULTADOS EXPUESTOS DEMUESTRAN QUE EL AGO PARTICIPA EN LA INVASION DE CELULAS EPITELIALES POR LA REGION BASOLATERAL EN CELULAS CACO-2 POLARIZADAS. EN ESTE MODELO AMBOS LARGOS DE CADENA (S-AGO Y VL-AGO) SON NECESARIOS PARA LA INVASION DE CELULAS COLONICAS. INTERESANTEMENTE, LA BAJA DISPONIBILIDAD DE O2, CONDICION PREVALENTE EN EL INTESTINO. AUMENTO LA EXPRESION DE AMBOS REGULADORES DEL GRADO DE POLIMERIZAICON DEL AGO. FINALMENTE EN EL INTERIOR DE LAS CELULAS EPITELIALES SE FAVORECE LA EXPRESION DE VL-AGO POR SOBRE S-AGO. |